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          蛋白質科學研究平臺生物成像中心在原位冷凍電鏡技術開發領域取得新進展

            

            7月8日,國際結構生物學領域權威期刊《Journal of Structural Biology》在線發表了由中國科學院生物物理研究所蛋白質科學研究平臺生物成像中心與孫飛研究組合作的技術創新成果《VHUT-cryo-FIB, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography》,針對組織樣品原位結構生物學研究的技術瓶頸開發了組織樣品冷凍含水切片制備技術VHUT-cryo-FIB,這是該中心在2016年開發的細胞樣品冷凍含水切片制備技術(Journal Structural Biology, 2016,194:218-222)后的又一技術創新,將原位結構生物學的研究對象從單細胞拓展到更接近于生理狀態的組織樣品。

            冷凍電子斷層成像技術(cryo-electron tomography,cryo-ET)是一項重要的冷凍電鏡技術,可以獲得細胞和組織樣品原位三維高分辨率超微結構、生物大分子的原位結構信息以及蛋白質機器原位相互作用信息。該技術被認為是分子生物學和細胞生物學聯結的橋梁,被稱為"可視化蛋白質組學"。然而該技術要求樣品的厚度必須在300nm以下,獲取高分辨率信息則需要更薄的樣品(150nm以下),但是大多數生物樣品厚度都在數微米以上,無法直接應用該技術進行研究。此外,為了研究生物組織樣品更接近生理狀態的結構,通常需要利用高壓冷凍技術對生物組織樣品進行冷凍固定,但是高壓冷凍后的樣品厚度一般都在100μm以上,如何制備出適合冷凍電子斷層成像技術研究的高質量的生物組織樣品切片是原位結構生物學領域面臨的一個重要技術問題。

            本項技術研究基于最新的冷凍聚焦離子束技術(cryo-FIB),設計和研制了一套冷凍傳輸硬件,有效將振顫切片技術、高壓冷凍技術、冷凍修塊技術和冷凍聚焦離子束減薄技術結合起來,創新冷凍聚焦離子束切割工藝,形成了一套完整高效的組織樣品冷凍含水切片制備技術流程VHUT-cryo-FIB。利用該技術流程可以高效制備出厚度在150-300nm之間的組織樣品冷凍含水切片。本研究中應用VHUT-cryo-FIB方法分別制備了菠菜葉片、小鼠骨骼肌、肝臟和心肌的冷凍含水切片,并成功解析了菠菜胞質核糖體(34 ?)和小鼠肝臟胞質核糖體(18 ?)的原位三維結構(圖1)。這些結果證明VHUT-cryo-FIB方法可以廣泛應用于各種生物組織樣品的冷凍含水切片制備,為原位結構生物學研究提供有力的樣品制備方法。

            孫飛研究員為該論文的通訊作者,高級工程師張建國、孫飛研究組張丹陽博士(已畢業)和高級工程師孫磊為共同第一作者。蛋白質科學研究平臺生物成像中心的多位工程師季剛、黃小俊、牛彤欣為該項成果貢獻了力量,徐偉研究員為實驗的設計和方向提供建議。北京大學生命科學學院的高寧教授和馬成英博士在小鼠肝臟核糖體數據分析方面給予了幫助。

            該工作受到國家自然科學基金委、科技部重點研發計劃、北京市科委等的資助。

            

          圖1. Cryo-FIB方法制備的冷凍含水切片樣品,Cryo-ET 方法解析菠菜葉片和小鼠肝樣品中核糖體三維結構。a菠菜葉片重構后的細胞內部結構,其超微結構包括細胞壁、細胞質、葉綠體、囊泡、核糖體和基粒。b三維渲染后的圖a,黃色,核糖體;淡粉色,細胞壁;橙色,細胞膜;紫色,囊泡;綠色,葉綠體膜;青色, 葉綠體基質。菠菜核糖體的原位結構,大亞基藍色的,小亞基黃色。c Subtomo average得到小鼠肝臟核糖體的原位結構(左),與通過單粒子重構得到小鼠胞質核糖體密度圖(右)。d小鼠肝臟核糖體原位結構密度圖,大亞基和小亞基分別為藍色和黃色。紅色(P/E位點)和紫色(A/P位點)顯示了兩個tRNAs。Scale bar:150nm。

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